技术介绍
邻近标记技术已被成功应用于鉴定蛋白靶标，相比传统的Pulldown/IP+MS技术，邻近标记技术可以解决鉴定弱或瞬时相互作用、研究膜蛋白等诸多问题。根据结核分枝杆菌类泛素蛋白酶体系统中底物Pup分子在体外能够招募PafA连接酶发挥邻近标记作用的实验原理，命名为Specific Pupylation as IDEntity Reporter (SPIDER)。该技术可应用于蛋白－蛋白、核酸－蛋白、小分子－蛋白等相互作用的验证和发现。
基于SPIDER邻近标记技术，仅需准备生物素化标记的诱饵分子（Biotin-bait），加入待反应样本（纯化蛋白、细胞裂解物或细胞）及SPIDER反应体系启动反应，诱饵分子（Bait）和目标蛋白（Prey）之间的非共价结合被转化为Prey和链霉亲和素（SA）之间的共价连接，随后与SA共价连接的Prey可以被生物素琼脂糖（Biotin-beads）亲和富集并进行质谱鉴定。
技术优势
- 无需提前将标签和Bait进行融合，摆脱对融合蛋白表达准确性的依赖
- 操作相对简单，应用范围更广
- 可用于鉴定弱或瞬时相互作用
- 可兼容完整细胞检测，特别适用于活细胞表面蛋白筛选
- 使用严苛的条件进行清洗，可显著降低非特异蛋白的干扰
- 富集能力强，结果准确性更高
实验目的
筛选客户提供蛋白的互作蛋白。
实验方案
实验设置为实验组1、对照组1。并且设置生物学重复。
实验步骤
- 实验组1中加入0.1 μM的Biotin-蛋白；对照组1中不加入蛋白
- 各反应体系中加入含3 mg蛋白的细胞裂解液，并用反应buffer补充体积到6 mL，4℃孵育过夜
- 孵育结束后加入终浓度为0.4 μM的SA-Pup，室温孵育20 min
- 孵育结束后加入终浓度为5 mM的ATP、0.1 μM的PafA，37℃旋转孵育30 min
- 孵育结束后在反应体系中加入4.8 g尿素，完全溶解后，加入0.1% Tween20、100 uL的biotin-agarose，室温孵育2 h
- 孵育完成后1500 rpm，4℃离心5 min去除上清
- 加入14 mL的Wash buffer Ⅰ，室温旋转5 min，1500 rpm离心5 min去除上清
- 随后加入14 mL的Wash buffer Ⅱ，室温旋转5 min，1500 rpm离心5 min去除上清
- 加入14 mL的Wash buffer Ⅲ，室温旋转5 min，1500 rpm离心5 min去除上清
- 后续进行质谱处理与靶蛋白鉴定
案例分析
蛋白-生物分子相互作用是生命活动的核心调控机制，现有方法存在特异性不足、适用范围受限等问题，为此研究团队开发了SPIDER（特异性普酰化身份报告技术）。
该技术融合结核分枝杆菌普酰化途径的底物邻近标记活性与链霉亲和素-生物素系统，通过突变改造获得关键组件SAₘ-Pupᴱ和PafA₇KR，可将生物素化诱饵与猎物蛋白的非共价结合转化为共价连接，结合8 mol/L尿素严苛洗涤，特异性与富集效率优于AP-MS、BioID等传统方法。
实验验证结果：
- 成功验证了CheAs-CheZ等经典蛋白-蛋白相互作用（Kd≈350 nmol/L）
- 有效检测Sox2与核酸、雷帕霉素与FKBP12等蛋白-核酸、蛋白-小分子相互作用
- 构建了THP-1细胞分化过程的mRNA-蛋白互作组，鉴定出279种互作蛋白
- 发现并通过SPR验证SRSF7为新型m⁶A阅读器（对m⁶A-ssRNA的亲和力比对照高2倍）
- 在H1299、Calu-3等细胞表面鉴定出55种SARS-CoV-2 RBD互作蛋白
参考文献
[1] Jiang HW, Chen H, Zheng YX, et al. Specific pupylation as IDEntity reporter (SPIDER) for the identification of protein-biomolecule interactions. Sci China Life Sci. 2023 Apr 14：1–19.
[2] Li WJ, Mei WY, Jiang HW, et al. Blocking the PD-1 signal transduction by occupying the phosphorylated ITSM recognition site of SHP-2. Science China Life Sciences. 2024.
Spider生物素标记法钓靶技术示意图